BMI theorieles 2

• Biologie
• MBO
• Studiejaar 3

BMI theorieles 2

Vandaag:

- qPCR

Leerdoel

Aan het einde van de les kun je uitleggen wat een qPCR is.

Wat is een qPCR?

qPCR

qPCR = quantitative polymerase chain reaction

Je kan zowel DNA kopiëren (zoals PCR) en ook meten hoeveel DNA er is in elke cycli.

Verschil tussen qPCR en PCR

PCR	qPCR
Visualisatie van DNA m.b.v. een gel	Visualisatie van DNA m.b.v. fluorescentie
Kwalitatief	Kwantitatief

Sleep elk kenmerk naar PCR of qPCR:

PCR

qPCR

Kwalitatief

Kwantitatief

Visualisatie DNA m.b.v. agarose gel

Visualisatie DNA m.b.v. fluorescentie

Welke componenten gaan er in een PCR reactie?

Componenten van een qPCR mix

1. Taq polymerase: Kopieert het DNA

2. Primers: Startpunt voor het verlengen van DNA.

3. dNTP's: bouwstenen voor DNA

4. Mg: co-factor voor Taq-polymerase

5. Fluorescente detectiecomponent: kan op twee manieren!

Detectiemethode 1: SYBR green

Bindt al het dubbelstrengs DNA (dus ook primer dimers!)

Dus.. bij elke cyclus heb je meer SYBR green -> wat gebeurt er dan met het fluorscente signaal?

Detectiemethode 2: Taqman probe

Bindt aan je enkelstrengs DNA (zoals een primer)

Zodra het kapot gaat, komt er fluorescentie vrij.

Voordeel?

Wat is het verschil tussen een Taqman probe en SYBR green?

Hoe wordt fluorescentie geïnterperteerd?

Bij elke cyclus verdubbelt je DNA → dus bij elke cyclus heb je meer fluorescentie.

De machine maakt er een amplificatiecurve van:

X-as: je aantal PCR-cycli

Y-as: je fluorescentiesignaal

qPCR amplificatiecurve

X-as: PCR cycli (cycle number)

Y-as: Fluorescentiesignaal 

Je bepaalt hiermee de Ct waarde: Cycle treshold.

Het is het eerste PCR-cyclus waarin je fluorescentie boven je achtergrond ruis uitkomt.

Wat betekent de Ct-waarde (Cycle threshold) in een qPCR-analyse?

1. De cyclus waarin de meltcurve begint
2. De cyclus waarin het DNA stopt met verdubbelen
3. De eerste cyclus waarin de fluorescentie duidelijk boven de achtergrond uitkomt
4. De cyclus waarin de polymerase-activiteit het hoogste is

Verdunningsreeks

Weinig DNA = hoge Ct-waarde

Veel DNA = lage Ct-waarde

Aan de slag!

Teken zelf een amplificatiecurve (zie werkblad)

Klaar? Start/maak af: je labjournaal die je wilt verzenden voor feedback.

Wat heb je deze les geleerd?