2.1 BIOT Microbiologie

• Biologie
• MBO
• Studiejaar 2

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Bronnen

• BIOP basis 2.1 : betrouwbare resultaten Thema "Microbiologie"

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Bouw van bacteriën 

Celtypen

Er bestaan 2 celtypen.

• Eukaryoten
• Prokaryoten

Bacteriën behoren tot de prokaryoten omdat:

1. Ze geen celkern bevatten
2. Klein zijn t.o.v een eukaryote cel
3. Minder complex gebouwd zijn. (bevatten minder celorganellen)

Opdracht: Bouw en functie van bacteriën/ celorganellen

Maak een tabel van 2 kolommen. 

Zet in de eerste kolom de namen van de celorganellen die te zien zijn in de afbeelding.  

Gebruik de 2de kolom om de functie van elk celorganel te omschrijven. 

Bron:

Biologie voor analisten 7de druk: H12.3.1

Biologie voor analisten 8ste druk: H11.4.1 

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Groei van bacteriën 

Voedsel

Ieder organisme heeft voedsel (nutriënten) nodig om te groeien. 

Gezond 'eten' bevat de juiste verhouding macro,- en micronutriënten. 

• Macronutriënten: C, H, O, N, P en S
• Micronutriënten: Mg (cofactor voor enzymen) en Fe (Hemoglobine)

Het voedsel bestaat uit biomoleculen.

Koolhydraten, eiwitten, vetten, nucleïnezuren 

Opdracht: Voedsel/ biomoleculen

Opdracht

Maak een tabel met 3 kolommen.

Plaats in kolom 1 de naam van een biomolecuul

Plaats in kolom 2 de naam van het monomeer waaruit het biomolecuul is opgebouwd

Zet in kolom 3 de macronutriënten waaruit het betreffende biomolecuul is opgebouwd. 

Bron:

Biologie voor analisten 7de druk: H13.3

Biologie voor analisten 8ste druk: H11.4.3

1.

De groei van bacteriën wordt beïnvloed door 5 factoren. 

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Groeifactoren

Temperatuur

Elk micro-organisme heeft zijn eigen minimumtemperatuur, een optimumtemperatuur en een maximumtemperatuur. 

• Onder de minimumtemp. is geen groei mogelijk
• Bij de optimumtemp is de vermenigvuldiging (groei) het sneltst
• Boven maximumtemp is geen groei mogelijk

Zuurgraad

Elke bacterie heeft zijn eigen pH bereik waarbinnen de groei optimaal is.  De meeste bacteriën groeien optimaal bij een pH van 7. 

Bacteriën die groeien bij een pH < 7 zijn acidofielen

3.

Zuurstof

Zuurstof is belangrijk voor de verbranding van biomoleculen. Verbranding levert de cel energie (ATP) en brengt weer marconutriënten beschikbaar voor de aanmaak van nieuwe biomoleculen die onmisbaar zijn voor de aanmaak van nieuwe celonderdelen. 

Afhankelijk van de zuurstofbehoefte kunnen bacteriën ingedeeld worden in groepen. 

5.

2.

Osmotische waarde/ Zoutconc.

De osmotische waarde (de zoutconcentratie waarin de cel zich bevindt) heeft invloed op de groei van bacteriën. 

Micro-organismen hebben water nodig om te groeien. 

Afhankelijk van de zoutconcentratie zullen cellen water opnemen of afstaan.

4.

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Invloed van groeifactoren op de levenskenmerken stofwisseling en groei

Effect groeifactoren - enzymen

Enzymen zijn eiwitten die een onmisbare rol spelen in de stofwisseling en daarmee op de groei van bacteriën.

 

Groeifactoren hebben invloed op de vouwing van eiwitten. 

Daardoor past het substraat niet meer op de actieve plaats van het enzym en vindt de omzettig NIET meer plaats

Effect groeifactoren - energie

Beschikbare energie is afhankelijk van het voedselaanbod (media) en de beschikbaarheid van zuurstof. 

De meeste bacteriën waarmee jullie werken hebben zuurstof nodig voor de volledige verbranding van biomoleculen. 

• Volledige verbranding van glucose: 36 ATP + CO2 + H2O
• Fermentatie van glucose: 2 ATP + organisch zuur
• Volledige verbranding van aminozuren: ATP + NH3 (= base)

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Praktijk: Opdracht yoghurt maken

Leerdoelen

• Je kunt een uitstrijkpreparaatje maken volgens protocol.
• Je kunt een Gramkleuring uitvoeren volgens protocol.
• Je kunt een gekleurd uitstrijkpreparaatje beoordelen op Gram-reactie, vorm en rangschikking.
• Je kunt het principe van de Gramkleuring uitleggen.
• Je (her)kent de biomoleculen die we in de experimenten gebruiken.
• Je kunt het verschil uitleggen tussen aerobe en anaerobe stofwisseling
• Je kunt op basis van de meetresultaten een conclusie trekken over de kwaliteit van de gemaakte yoghurt 

De leerdoelen bereik je door de lesstof te bestuderen zoals deze genoemd is in de praktijkbundel biologie en door de vragen en uitwerking te maken horende bij dit practicum.

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Praktijk: Opdracht groeifactoren

Leerdoelen

• Je kunt het effect van groeifactoren op de stofwisseling uitleggen.
• Je kunt het effect van groeifactoren op de werking van enzymen uitleggen.
• Je kunt de kwaliteit van media borgen door de juiste controles te kiezen

De leerdoelen bereik je door de lesstof te bestuderen zoals deze genoemd is in de praktijkbundel biologie en door de vragen en uitwerking te maken horende bij dit practicum.

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Praktijk: Opdracht determinatie bacterie

Leerdoelen

• Je kunt een uitstrijkpreparaatje maken volgens protocol.
• Je kunt een Gramkleuring uitvoeren volgens protocol.
• Je kunt een gekleurd uitstrijkpreparaatje beoordelen op Gram-reactie, vorm en rangschikking.
• Je kunt het principe van de Gramkleuring uitleggen.
• Je (her)kent de biomoleculen die we in de experimenten gebruiken.
• Je kunt het verschil uitleggen tussen aerobe en anaerobe stofwisseling.
• Je kunt het effect van groeifactoren op de werking van enzymen uitleggen.
• Je kunt uitleggen wat de functies van selectieve en electieve stoffen zijn in een kweekmedium.
• Je kunt de kwaliteit van media borgen door de juiste controles te kiezen.
• Je kunt de resultaten overzichtelijk rapporteren in een meetrapport

Selectieve stoffen

Selectieve stoffen in een medium zorgen ervoor dat een bepaalde groep bacteriën niet meer kan groeien. 

Voorbeelden van deze stoffen zijn: kristalviolet en galzouten

Electieve stoffen

Electieve stoffen in een medium tonen een biochemische eigenschap (enzym) aan.

De electieve stoffen:

Biomolecuul + pH indicator

Vb: glucose         fenolrood

Als een koolhydraat wordt gefermenteerd, dan ontstaat er een organisch zuur. Dit zuur zorgt voor een pH daling. 

Die pH daling wordt zichtbaar gemaakt door de pH indicator. 

Als een aminozuur wordt omgezet ontstaat en NH₃. Omdat NH₃ een base is, stijgt de pH. Die stijging wordt zichtbaar gemaakt door de pH indicator. 

Determinatie van een bacterie verloopt in 3 stappen.

1: Macroscopie = koloniebeschrijving

2: Microscopie = preparaat maken + Gram kleuring

3: Biochemische testen

Om betrouwbaar te kunnen determineren is een reinkweek nodig en dus media.

Aan standaard media kunnen stoffen worden toegevoegd om bacteriën te isoleren en te differentiëren

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Bonte-rij

• Een reeks buizen met media waaraan electieve stoffen zijn toegevoegd.
• Daarmee is de aan of afwezigheid van enzymen aan te tonen.
• De optelsom van de reeks enzymen die wel of niet aangetoond zijn,  vormen   een soort                       die uniek is voor een bacterie.
• De                      die de school gebruikt, is alleen geschikt voor Gram- neg staafvormige bacteriën (Enterobacteriacaea). 

Barcode

bonte- rij

De bonte rij, zoals die op school gebruikt wordt, bestaat uit 6 buizen met de volgende media:

1. Double-Sugar-Iron (DSI) ook wel Kliglerijzer-agar (KIA) genoemd.
2. Lysinedecarbolylase-medium (LDC-agar). 
3. Ornithinedecarboxylase-medium (ODC-agar).
4. Peptonwater.
5. Ureum-agar.
6. Inositol-medium.

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

1: DSI (double sugar iron)

Medium

Vast, rood/oranjeachtig medium met schuinoppervlak

Wijze van enten

Rechte streep met steekent

Ingrediënten

2 suikers (glucose en lactose 1:10)

pH indicator = fenolrood

Neutraal=rood

Zuur=geel

Basisch=roze

Na₂S₂O₃ en IJzercitraat

Eigenschappen

1: Glucose fermentatie (alleen gele stomp)

Bij glucosefermentatie ontstaan zure producten pH indicator rood -geel

2: Lactose fermentatie (hele buis geel)

Bij lactosefermentatie ontstaan zure producten pH indicator rood-geel

3: Zwerming (groei over gehele oppervlak)

Bacterie kan voortbewegen over het oppervlak met flagellen

4: Zwavelreductie (zwarte neerslag)

Reductie van NaS₂O₃ waarbij H₂S gas vrij komt. 

Het Fe uit Ijzercitraat reageert met de S tot FeS (zwart)

5: Gasvorming (gasbellen/scheuren)

4: Peptonwater

Medium

Vloeibaar medium

Wijze van enten

Met een steriele ose net onder het vloeistof-oppervlak tegen de wand van de buis

Ingrediënten

Tryptofaan (aminozuur)

Eigenschappen

1: Bezit van het enzym tryptofanase. Het enzym zet tryptofaan om in indol en pyruvaat. De indol wordt aangetoond met KOVACS reagens. Een giftig reagens dat drijft op de vloeistof. 

Bij een positieve reactie drijft er een rode ring op het medium

Bij een negatieve reactie drijft en een gele ring op het medium 

5: Ureum

Medium

Vast, geel medium met schuin oppervlak

Wijze van enten

Alleen slingerent, zigzagent met een steeköse

Ingrediënten

Ureum

pH indicator = fenolrood

Neutraal=rood

Zuur=geel

Basisch=roze

Eigenschappen

1: Bezit van Urease

Ureum wordt omgezet tot ammoniak (NH3) en CO2. 

NH3 is basisch waardoor de kleur omslaat van gelig naar roze 

6: Inositol

Medium

Vloeibaar medium met rode kleur

Wijze van enten

Met een steriele ose net onder het vloeistof-oppervlak tegen de wand van de buis

Ingrediënten

Inositol (= koolhydraat)

pH indicator = fenolrood

Neutraal=rood

Zuur=geel

Basisch=roze

Eigenschappen

1: fermentatie van inositol 

Als de buis na incubatie geel is, dan is er zuur gevormd uit inositol. De reactie is dan positief. 

2: LDC (Lysine decarboxylase)

Medium

Paars, vast medium, schuin gestold

Wijze van enten

slingerent en steekent

Ingrediënten

Lysine (aminozuur)

pH indicator = Broom Cresol Purper

Basisch: paars

Zuur: geel

Ijzer-ammoniumcitraat

Eigenschappen

1: Bevat het enzym lysinedecarboxylase (paarse stomp)

CO₂ wordt afgesplitst van COOH groep en ontsnapt uit de buis. 

Wat overblijft is basisch, de indicator wordt paars in de stomp.

2: Bevat het enzym lysinedeaminase (rood oppervlak)

NH₂-groep wordt afgesplitst en omgezet tot NH₄⁺. 

Dit reageert met ijzer-ammoniumcitraat tot een zuur product bij het oppervlak.

3: ODC (Ornithinedecarboxylase)

Medium

Halfvast medium met paars gele kleur

Wijze van enten 

Steekent

Ingrediënten

Ornithine (aminozuur)

pH indicator = Broom Cresol Purper

Basisch: paars

Zuur: geel

glucose

Eigenschappen

1: Bezit van het enzym ornithinedecarboxylase

CO₂ wordt afgesplitst van COOH groep. Door het basische restproduct blijft de buis paars

Negatieve buis wordt geel door verzuring tgv. glucosefermentatie

2: Beweeglijkheid

Groei naast de steeklijn (aftakkingen of troebel)

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Selectieve en differentiërende media

McConkey agar

Ingrediënten

       Selectieve stoffen: kristalviolet, galzouten

                                  * Remmen de groei van Gram- pos                                 

       Electieve stoffen: Lactose en pH indicator 

                                 * Gram- neg (= darmbacteriën)  

                                   op basis van hun mogelijkheid om lactose te fermenteren.

                                  

Selectief en differentieël

Door de aanwezigheid van selectieve stoffen in het medium groeien bepaalde groepen bacteriën NIET.

Door de aanwezige electieve stoffen in het medium wordt op basis van een biochemische eigenschap (enzym) onderscheid gemaakt binnen de groep die WEL groeit. 

Door de aanwezigheid van die biochemische eigenschap ontstaan er verschillen in macroscopische eigenschappen binnen de groep die groeit. 

Groeperen

1: Commensalen kunnen lactose fermenteren (lactose positief) waarbij de geproduceerde zuren vrijkomen in het medium. Het verlaagt de pH van het medium waardoor er rode of roze gekleurde kolonies ontstaan. 

2: Pathogene bacteriën zoals Salmonella en Shigella zijn lactose negatief en produceren dus geen zuur. De kolonies blijven daarom kleurloos en doorzichtig.

Neutraalrood

pH< 6,8 = rood

Werking Mc Conkey agar

Kwadrant 1: 

Deze bacterie wordt niet geremd door galzouten en kristalviolet en is een Gram negatieve bacterie. De roze kleur van de bacteriegroei geeft aan dat deze bacterie lactose kan fermenteren. Het is dus een gram negatieve commensaal.

Kwadrant 2: 

Deze bacterie wordt niet geremd wordt door galzouten en kristalviolet en is een Gram negatieve bacterie. De roze kleur van de bacteriegroei geeft aan dat deze lactose kan fermenteren. Het medium rondom de kolonie is ook roze gekleurd vanwege het vele zuur dat geproduceerd wordt. Dit is dus ook een commensaal.

Kwadrant 3: 

Afwezigheid van groei geeft aan dat deze bacterie wordt geremd door galzouten en kristalviolet en een Gram-positieve bacterie is.

Kwadrant 4: 

Deze bacterie wordt niet geremd door galzouten en kristalviolet en is een Gram negatieve bacterie. De afwezigheid van kleur in de bacteriegroei geeft aan dat de bacterie lactose niet kan fermenteren en dus een pathogeen is.

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Kwaliteit in de microbiologie

Een laborant moet de betrouwbaarheid van zijn resultaten kunnen onderbouwen. De betrouwbaarheid van het resultaat wordt bepaald door:

1: 

2:  

3:

(Meet) apparatuur

1. Autoclaaf = controle door autoclaaf tape.
2. Broedstoof = kwaliteit procesbeheersing = controlekaart

Media

Doen de media dat wat jij mag verwachten? 

Controle door inzetten controlemonsters

1: Steriliteits controle 

= je controleert het maakproces van het medium

2: Positieve controle

 = je controleert de werking van selectieve en electieve stoffen 

3: Negatieve controle

= je controleert of de selectieve en electieve stoffen alleen werken in de juiste situatie (specificiteit)

Vaardigheid

Bewust en consequent handelen op basis van kennis en ervaring

(kwaliteit: vaardig of onnauwkeurig) 

P2.1 Basisanalist: Microbiologie

Controleren van de media

Om de juiste kwalitatieve controles in te zetten, is het noodzakelijk dat je werking van de media kent. 

Met behulp van de literatuur/ AI kies je stammen uit de collectie die zowel pos als negatief reageren op de media. Daarmee worden de ingrediënten op hun werking getest

Opdracht: kwaliteit microbiologie

Naast de steriliteitscontrole zetten jullie een positieve en negatieve controle in. 

Welke stammen uit de stammencollectie zetten jullie in als :

1: positieve controles

2: negatieve controles

Geef bij alle controles aan wat je controleert