H4 Microbiele controles

• Microbiologie
• MBO
• Studiejaar 2

 Microbiële controles

Microbiële controles

Voor het onderzoeken van voedselveiligheid en voedselkwaliteit

Allereerst worden er monsters genomen, waarbij de micro-organismen worden opgekweekt. 

Na tellen en identificatie worden de resultaten geïnterpreteerd en zo nodig actie ondernomen

Bemonsteringmethodes

De gesteldheid van producten wordt gecontroleerd door alle producten te bemonsteren

  

Bij partijen is er een onderscheid tussen vaste stoffen en vloeistoffen. Vaste vloeistoffen die zich gedragen als vloeistoffen noemen we free-flowing

Voor de bemonstering van oppervlakten kan een stempelplaatje of wattenstaafje worden gebruikt

Monsterneming en transport

Een monster moet zodanig worden genomen dat het niet van buitenaf kan worden besmet

Transport moet dusdanig plaats vinden zodat de microbiologische samenstelling niet verandert

Monster moet gekoeld worden en binnen 24 uur geanalyseerd

Omvang steekproef

Afhankelijk van:

aard van het product

omvang van de productiepartij

de soort micro-organismen die je gaat onderzoeken

de voorgeschiedenis van de partij

relevante wetgeving

Aard productie

In vaste stoffen (zoals poeders) zijn de micro-organismen vaak ongelijkmatig verdeeld. 

Bij vloeistoffen zijn homogener waardoor je met minder monsters kan volstaan dan bij de vaste stoffen

Omvang productiepartij

Aantal monsters is gelijk aan de wortel van de omvang van de partij

Voorbeeld: je hebt 80 dozen, √80 = 8,9, dus je neemt 9 monsters

Soort micro-organismen

Hoe groter het gezondheidsrisico van de te onderzoeken micro-organismen, des te groter de omvang van de steekproef

Voorgeschiedenis van de partij

Onbekende voorgeschiedenis betekent groter steekproef dan bij een bekende voorgeschiedenis 

Voorgeschiedenis: productie, wijze van opslag en transport

Representatief monster

Kiezen van monster uit een partij moet aselectief gebeuren

Welk product kan je bemonsteren met een steker?

1. Kaas
2. Olijfolie
3. Cacaoboter
4. Water

Wetgeving

Er bestaat een wettelijk verplicht voedselveiligheidssysteem 

Proceshygiënecriteria zijn er voor de controle van het productieproces. Deze geven meestal niet een direct risico. 

Voedselveiligheidscriteria zijn er voor de controle op pathogenen. Deze kunnen een (groot) risico vormen voor de volksgezondheid. 

HACCP

Grote bedrijven  -> door het bedrijf zelf

Kleine bedrijven -> algemene criteria (hygiënecodes)

HACCP

• Controle van productieproces op mogelijke gevaren
• Benoemen van gevaren
• Beheersing van gevaren

Voedingsbodems

Opkweken gebeurt doorgaans op vaste voedingsbodems of in een bouillon. De micro-organismen in de voedingsmiddelen industrie hebben voor snelle groei de volgende stoffen nodig:

• Bouwstoffen (eiwitten en aminozuren)
• Brandstoffen (koolhydraten en aminozuren)
• Beschermende stoffen (mineralen en vitaminen; doorgaans bouwstoffen voor aminozuren

Algemene voedingsbodems

De meeste bacteriën worden op plate count agar (PCA) gekweekt. Omdat de meeste micro-organismen hierop groeien, noemen we dit een algemene voedingsbodem. Met behulp van deze plaat stellen we het aerobe kiemgetal vast.

 Totale aerobe kiemgetal 

Het totale aerobe kiemgetal wordt uitgevoerd door het tellen van de kolonies die groeien op een algemeen vast medium bij een bepaalde temperatuur en tijd, onder aerobe incubatieomstandigheden.

Selectieve voedingsbodems

Deze voedingsbodems bevatten specifieke stoffen om de groei van een gewenste bacteriesoort vast te stellen. Vaak bevatten ze ook antibiotica om de groei van andere soorten te remmen.

Selectieve voedingsbodems

Bepaling van het kiemgetal van gisten en schimmels gebeurt meestal op een plaat waaraan oxytetracycline aan is toegevoegd, waardoor bacteriën niet tot ontwikkeling komen

Selectieve voedingsbodems

Een bouillon met selectieve stoffen (= ophopingsvloeistof) wordt gebruikt om bepaalde micro-organismen te vermeerderen, waarna ze worden geïdentificeerd met PCR of ELISA

Selectieve voedingsbodems

Electieve stoffen tonen aan dat een bepaald micro-organisme zich heeft vermeerderd

De functie van agar in een voedingsbodem is:

1. Electieve stof
2. Bindmiddel
3. Selectieve stof
4. Antibioticum

Deze stof wordt aan voedingsbodems toegevoegd om schimmels en gisten wel te laten groeien, maar bacteriën niet

1. penicilline
2. ampiciline
3. oxytocine
4. oxytetracycline

kweken en tellen van micro-organismen

Bij de standaard plaattelling worden micro-organismen geweekt op een plaat waarna de kolonies worden geteld. Als het kiemgetal te hoog is, wordt een verdunningsreeks gemaakt

kweken en tellen van micro-organismen

Bij de gietplaatmethode wordt 1 ml decimale verdunning gemengd met 15 ml voedingsmedium, na mengen wordt de petrischaal uitgegoten

spatelplaat-methode

Bij de spatelplaatmethode strijken we 0.1 ml van de decimale verdunning over een voedingsbodem uitgestreken met een Drigalski-spatel

Membraanfiltratie

Bij lage aantallen in vloeistoffen wordt de vloeistof gefiltreerd over een membraan. 

Alle micro-organismen blijven op het membraan. 

Het membraan wordt op een voedingsbodem gebracht en daarna opgekweekt. 

Petrifilm

Commercieel verkrijgbare petrifilms vormen een alternatief voor agar-platen. Er wordt 1 ml van een vloeibaar monster op het centrum van de film gepipetteerd, waarna er geïncubeerd wordt

Rodac

Bepalen van kiemgetal van een oppervlak

Plaatje wordt op de te onderzoeken oppervlakte gedrukt en daarna gekweekt

ATP

Een ATP-meting geeft binnen 5 seconden aan of reiniging en desinfectie afdoende is geweest. 

De aanwezigheid van ATP duidt op aanwezigheid van levende micro-organismen (en verdwijnt 2 uur nadat een cel is doodgegaan)

Een drinkwaterbedrijf wil monsters drinkwater onderzoeken op de aanwezigheid van pathogenen. Wat is de meest voor de hand liggende methode?

1. Rodac-plaatje
2. Petrifilm
3. Strijkplaatmethode
4. Membraanfiltratie

Telling, indeling en identificatie

Het aerobe kiemgetal is het aantal kolonies dat zich per gram of per ml monster kan ontwikkelen op platen na bebroeding. 

De monsters waar meer dan 300 kolonies op de plaat worden verwacht, worden verdund

Bevestiging

Na kweken en tellen wordt een bevestigingsreactie uitgevoerd om een voor de bacterie specifieke enzym aan te tonen

Zichtbare kenmerken van kolonies kunnen ook gebruikt worden. 
 

Kleuringen

Bij een enkelvoudige kleuring worden de cellen met 1 kleurstof(methyleenblauw) gekleurd

Bij een differentiële kleuring (Gram-kleuring) worden 2 of meer kleurstoffen gebruikt

Gramkleuring

Identificatie op basis van stofwisseling

Assimilatie: als een bacterie een biochemische stof gaat omzetten, begint het met de opname of assimilatie ervan.

Bijvoorbeeld als bacteriën de suikers omzetten, daalt de pH en verandert een indicator van kleur. De bacteriekolonies krijgen dan een andere kleur ten opzichte van de voedingsbodem

Identificatie op basis van stofwisseling

Bij afbraakreacties (= dissimilatie) van koolstofverbindingen kunnen gassen vrijkomen die in een vloeibare bouillon goed kunnen worden aangetoond met een Durhambuisje

Indicator organismen

Het aantonen van pathogene micro-organismen is vaak moeilijk en tijdrovend. Daarom worden indicator organismen gebruikt.

In drinkwater kan snel E. coli worden aangetoond. Wanneer dat zo is, bestaat er een grote kans dat het water ook met Salmonella is besmet

Enzymen aantonen

Een goede methode is het aantonen van bacteriële enzymen. 

Afhankelijk van de eigenschappen, beschikken ze al dan niet over enzymen zoals katalase en oxidase en beta-galactosidase 

Katalase

Katalase is een enzym dat zich bevindt in de peroxisomen van eukaryote cellen, plantencellen en cellen van aerobe bacteriën. 

Dit enzym zet waterstofperoxide om in water en zuurstofgas, een exotherme reactie

Oxidase

Een oxidasetest is een test om te bepalen of een bacterie cytochroomoxidasen produceert. 

Er is een eenvoudige, snelle en goedkope test om de strikt aerobe micro-organismen zoals Pseudomonas te onderscheiden van de facultatief anaerobe micro-organismen zoals de Enterobacteriën.

beta-galactosidase 

Met het enzym beta-galactosidase kunnen bacteriën splitsen in glucose en galactose

Proteus vulgaris hebben dit enzym niet en kunnen daardoor lactose niet als energiebron gebruiken

Snelle detectiemethoden

Vaak wordt een PCR (polymerase chain reaction) gebruikt om snel te achterhalen om welk soort bacterie het gaat

Hierbij wordt er bepaald uit welk DNA het micro-organisme bestaat, waardoor ze het kunnen koppelen aan het juiste micro-organisme

Immunologische testen 

Bij een immunologische test worden antistoffen gebruikt die specifiek zijn voor een bepaald bacteriesoort. 

Vindt er reactie plaats, dan is de bacterie aanwezig

Welk organisme is indicator van (na)besmetting met menselijke ontlasting

1. Enterobacteriaceae
2. E. coli
3. Schimmels
4. Gisten

Als je snel wilt weten of er ziekteverwekkers in de ophopingsvloeistof zitten, kies je voor de PCR-methode

1. Juist
2. Onjuist

Bij de PCR-test kan je in één keer bepalen welke verschillende soorten micro-organismen in één monster zitten

1. Juist
2. Onjuist

Wat heb je geleerd?

Hoe je partijen en oppervlakken kan bemonsteren

Waar de omvang van een steekproef afhankelijk van is

Dat je micro-organismen kunt tellen door ze te kweken op verschillende voedingsbodems

Wat de samenstelling van een voedingsbodem is

Welke methodes je gebruikt voor het tellen van bacteriën

Wat heb je geleerd?

Welke methodes je kan gebruiken voor het identificeren van bacteriën. 

Welke micro-organismen in de voedingsmiddelenindustrie als indicator-organismen worden gebruikt

Hoe je microbiologische onderzoeksgegevens moet interpreteren.