T4B2 - DNA-replicatie
T4B2 - DNA-replicatie
Lesson duration is: 50 minItems in this lesson
T4B2 - DNA-replicatie
Leerdoelen
10.2.1 Je kunt uitleggen hoe DNA-replicatie plaatsvindt.
10.2.2 Je kunt uitleggen hoe de basenvolgorde van DNA kan worden bepaald.
10.2.3 Je kunt uitleggen hoe DNA-analyse kan worden toegepast om verwantschap tussen organismen vast te stellen.
Begrippen BS2
S-fase
DNA-replicatie
helicase
replicatiebel
primer
DNA-polymerase
afleesrichting
leidende streng
Okazaki-fragmenten
DNA-ligase
volgende streng
telomeer
PCR
sequencen
gelelectroforese
DNA-fingerprint
restrictie enzymen
Celdeling
Door middel van celdeling maak je van een cel een identieke dochter cel. Deze cel moet dus ook hetzelfde DNA hebben.
Celdeling start dus ook altijd met het kopieren van DNA, ook wel replicatie genoemd.
DNA-replicatie vindt plaats tijdens de S-fase
(binas tabel 71D)
Bouw van DNA
Nucleotide = suiker + fosfaat + base
'5 uiteinde: een fosfaatgroep
'3 uiteinde: een OH-groep
Leesrichting: 3' naar 5'
(DNA polymerase van 5' naar 3')
stap 1
1. Waterstofbruggen van de basenparen worden vanaf replicatiestartpunt in twee richtingen verbroken door enzym helicase.
2. Ds-DNA wordt ss-DNA.
3. Hierdoor ontstaat een replicatiebel.
-> replicatiebel
stap 2
Single-strand DNA-binding proteins (SSBP's) binden aan het ssDNA, zodat de H-bruggen niet worden hersteld
stap 3
De primer hecht aan het ssDNA aan de 3' kant.
primers worden door het enzym primase gemaakt
primer is aanhechtingspunt voor DNA-polymerase, want DNA-polymerase kan alleen nucleotiden kan vastplakken aan het 3’-uiteinde
DNA-polymerase
werkt vanaf de 3'-kant
vanaf 3' kant primer worden dNTPs (deoxynucleotidetrifosfaat) toegevoegd.
Hiervoor wordt energie gebruikt door splitsen van 2 fosfaatgroepen.
dAMP, dTMP, dGMP, dCMP
DNA replicatie
Afleesrichting DNA polymerase: 3' naar 5' uiteinde
Nieuwe streng wordt gemaakt in richting 5' naar 3' uiteinde.
Nucleotide bindt dus aan 3' uiteinde
DNA-polymerase
In een replicatiebel wordt het dubbelstrengs DNA in twee richtingen opengeritst (A).
Leading streng (leidende streng): DNA-polymerase kan aaneensluitend nucleotiden toevoegen.
Lagging streng (volgende streng) DNA-polymerase kan steeds maar korte stukje DNA (okazaki-fragmenten) maken vanaf een primer, omdat dit achterwaarts gebeurd (wachten op helicase).
Lagging strand
in de andere richting wordt er gebruik gemaakt van Okazaki-fragmenten
kleine stukjes DNA die worden ingebouwd
stukjes worden door DNA ligase aan elkaar gemaakt
Na replicatie bestaat een chromosoom uit 2 chromatiden (een nieuwe en een oude).
Tijdens mitose gaan chromatiden uit elkaar.
Elke dochtercel zal dan ook voor de helft uit het DNA van de origenele cel bestaan
Telomeren en veroudering
RNA-primer uiteinde DNA-streng wordt verwijderd.
Hierdoor kan het uiteinde van een enkelvoudige DNA-keten niet worden gerepliceerd, en wordt verwijderd.
Het DNA-molecuul wordt korter.
Om DNA-schade te voorkomen bezitten de uiteinde van chromosomen: telomeren.
Telomeer
niet-coderend DNA
beschermd de uiteinde
repeterend: 5' TTAGGG 3'
na elke celdeling korter
bij geboorte 11000
na 50 delingen 1/5 over
bepaald levensduur van organisme
Aan de slag!
DNA technieken
PCR - polymerase chain reaction
Sequencen
gelelectroforese (en restrictieenzymen)
DNA-fingerprinting
PCR:polymerase chain reaction
DNA uit cellen (of moordonderzoek) is vaak te weinig voor onderzoek.
DNA replicatie
3 stappen (denatureren 94*C)/ hybridiseren (52*C)/ aangroei (72*C))
warmte bestendige polymerase
Wat moet je allemaal toevoegen aan het PCR cycler?
PCR:polymerase chain reaction
nodig:
PCR machine
forward en reverse
primers 20-30 nucleotiden
DNA-nucleotiden
DNA-polymerase
DNA template
PCR
herhaling stappen tot wel 40 keer. herhaling stappen tot wel 40 keer tot er genoeg materiaal is om te analyseren
- DNA-NTPs kunnen opraken
dsDNA smelten zodat er ssDNA ontstaat -> 95 *C
primers hechten -> 65 *C
DNA-polymerase synthetiseert het nieuwe DNA -> 72*C
Sanger sequencing
Eerst DNA-vermenigvuldigen
Denaturatie DNA (95*C)
Primer (95*C)
DNA polymerase maakt nieuwe keten (72*C)
Vervolgens 4 PCR-reacties, waarbij je bij elke reactie een kleine hoeveelheid van één specifiek ddNTP toevoegt (ddA, ddT, ddG, ddC)
ddNTPs, missen OH-groep zodat de replicatie stopt en er fragmenten van verschillende grote ontstaan.
Fragmenten van verschillende grootte
5’ - CGTAGCTATCGA** - 3’ (DNA-sequentie)
CGTA → kort fragment (laag in de gel, snel gemigreerd)
CGTAGCTA → langer fragment (hoger in de gel, trager gemigreerd)
CGTAGCTATCGA → nog langer fragment (nog hoger in de gel)
Gelelektroforese
Elektroforese scheidt de fragmenten op lengte.
DNA is negatief.
Door spanning migreren DNA fragmenten naar positieve pool
Hoe kleiner hoe makkelijker de fragmenten door de gel migreren
Gelelektroforese
De kortste fragmenten (die vroeg stoppen) bewegen het snelst door de gel en bevinden zich onderaan.
Aflezen volgorde
De kleinste fragmenten (onderaan in de gel) geven de eerste base van de sequentie aan.
De volgende fragmenten geven de daaropvolgende bases aan.
Door de banden van onder naar boven te lezen, bepaal je de complementaire DNA-volgorde.
Sanger sequencing en gelelektroforese
Sanger sequencing en gelelektroforese
DNA-fingerprinting
het niet coderende DNA bevat veel herhalingen (repeterende fragmenten)
hoe vaak zo'n stukje wordt herhaald is uniek per persoon
kan verschillen tussen de chromosomen
net zo uniek als een vingerafdruk
Voor DNA-profiel worden beide allelen van minimaal 10 loci met repetitief DNA onderzocht.
DNA-fingerprinting
Voor analyse wordt DNA eerst vermeerderd (met PCR) en vervolgens knipt men de loci met repeats uit DNA.
Gebeurt met restrictieenzymen afkomstig uit bacteriën.
Enzymen die stukjes van 4-8 nucleotiden kunnen herkennen en vervolgens het DNA daar knippen
gebruikt in de researchlab's op PCR fragmenten voor het kloneren, samenstellen van genen
DNA-profiel
Verwantschap familie
Forensisch onderzoek
Welke man (man 1, 2 of 3)
is de vader van het kind?
Wie heeft zijn DNA achtergelaten
op plaats delict?
Wie heeft zijn DNA achtergelaten
op plaats delict?
Aan de slag!
