Les 5 BMI

Les 5: kolonie PCR en uitleg PTC2

Vandaag

- terugblik op kolonie PCR - heeft iedereen het begrepen?

- PTC2 en welke bandjes je kan verwachten

- zelfstandig werken: beschrijving of flowchart

Vrijdag 13 juni

- restrictie enzym analyse PTC2 

- kolonie PCR

- inhalers: restrictie enzym analyse PTC1

Leerdoelen

Je kan uitleggen wat een kolonie PCR is en welke stappen hierbij betrokken zijn.

Je kan uitleggen welke puntmutaties je onderzoekt met het PTC2 experiment.

Je kan kan op basis van de PCR resultaten bepalen met welke kolonie je te maken hebt.

Waarom kolonie PCR?

Je hebt een plaat waarvan je niet meer weet welke soort bacterie je hebt. Of je wilt weten welke insert erin zit.

Dit kun je controleren met een kolonie PCR --> sneller dan normale PCR

Waarom doe je een kolonie PCR?
(geen naam zichtbaar)

Eerst kolonie's voorbereiden voor de PCR

Met hoeveel kolonie's doe je een kolonie PCR?

1. 1
2. 2
3. 3
4. 4

Welke DNA hebben deze kolonie's?

Met deze vier kolonie's doe je een kolonie PCR.

Je controleert welke DNA ze hebben: pGFP of pGLO?

Je neemt ook drie controles mee:

- controle DNA pGLO

- controle DNA pGFP

- milli Q

Pipetteerschema

Resultaten interpreteren

pGLO: bandje 1070 bp

pGFP: bandje van 2,7 kb (2700 bp)

Let op: 1 KB ladder

Hiernaast: pGFP of pGLO?

Welke DNA hebben de kolonies van plaat 2?

1. pGFP
2. pGLO

Deel 2: PTC 2

Welke bandjes kan je verwachten?

Als je je kolonie's hebt voorbereid, maak je daarna een mastermix

In de mastermix gaat alles behalve het DNA!!

Waarom? Het is veel sneller dan alle PCR componenten in elk epje doen.

Je maakt dus in een 1,5 mL epje je mastermix en daarvan pak je 22 µl die je in elk PCR epje doet.

Wat was het totaal volume voor één mastermix?

1. 250
2. 200
3. 150
4. 100

Je hebt twee mastermixen

Je wilt namelijk weten: is je kolonie pGLO of pGFP?

Dus: je maakt een mastermix voor pGLO en een mastermix voor pGFP.

Totaal volume van je mastermix: 200 µl. 
Je maakt dit namelijk voor 8 reacties.

Deel 2: 785 C > G

Met restrictie enzym Fnu4H1.  Herkent GC/NGC. Drie mogelijkheden:

Fenotype	Restrictie site aanwezig?	Aantal banden op gel
Taster	Ja	Twee: 241 bp en 62 bp
Mild taster	Één allel wel	Drie: 241 bp, 62 bp, en 303 bp.
Non-taster	Nee	Één: 303 bp

Fenotype	Restrictie site aanwezig?	Groottes op gel
Taster
Mild taster
Non-taster

Sleep de juiste antwoorden naar het tabel.

Ja

Nee

Deels

241

241

303

303

62

62

Aan de slag

Wat? Maak een flowchart of beschrijving wat je per praktijkles gaat doen: dus, wat doe je op 6 juni en wat doe je op 13 juni? 

Hoe? Dit doe je individueel, bij hulp vraag je het eerst je buurman/buurvrouw. Daarna vraag je het aan mij.

Hoelang? De hele les, op de laatste 5 minuten na.

Uitkomst? Je bent klaar met de flowschema/beschrijving en je hebt deze naar mij gestuurd.

Klaar? Lees alvast de praktijkvoorschrift door voor de kolonie PCR.

Leg nu in je eigen woorden uit hoe je de kolonie PCR gaat uitvoeren (dus: jij, niet ChatGPT ;)).
(namen zichtbaar)

Je bent een taster en bent heterozygoot (Tt). Hoeveel bandjes verwacht je?

1. 1
2. 2
3. 3
4. 4

Je bent een non-taster. Op welke hoogte verwacht je een bandje?

1. 241
2. 62
3. 303
4. 400

Welke DNA hebben de kolonies van plaat 1?

1. pGLO
2. pGFP

Wat heb je geleerd vandaag?
(namen zichtbaar)