P2.3 BIOT Branchetaak kip

• Biologie
• MBO
• Studiejaar 2

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Bronnen

BIOP 2.3  basis : zicht op analyseren

Thema "Branchetaken"

Opdracht Kip

Levensmiddelen microbiologie

Voedsel bevat                                    en                                        micro-organismen. 

 

gewenste

Nuttige/functionele micro-organismen zoals gisten (bier, wijn, brood) en schimmels (kaas). 

ongewenste

Pathogene micro-organismen die bederf van het voedsel veroorzaken en ziekte bij de persoon die het binnenkrijgt.

Bijvoorbeeld: Salmonella, bepaalde E. coli stammen en Staphylococcus aureus

voedselvergiftiging

Je wordt ziek van de gifstoffen die het micro-organisme produceert.  Symptomen treden binnen 2 tot 6 uur op en gaan meestal gepaard met braken. Je bent er meestal binnen 1 dag weer vanaf.

voedselinfectie

Je wordt ziek van het micro-organisme zelf nadat het zich heeft vermenigvuldigd in je lichaam. Symtomen treden na 8-24 uur op in de vorm van buikklachten, koorts en diarree. Deze houden 1 tot 3 dagen aan.

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Voorbeelden van gewenste micro-organismen in voedingsmiddelen

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Wanneer zijn micro-organismen ongewenst?

Wanneer ze een risico vormen voor de consument!

• Teveel micro-organismen in bv. drinkwater, voedsel of zwemwater.
• Bij mensen met een verminderde weerstand  
• Wanneer micro-organismen toxinen aanmaken.

Vraag: 

Wat is de vakterm voor deze ongewenste micro-organismen? 

Yopi's

Young, old pregnant immunosuprressed

Pathogenen

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Pathogene micro-organismen

Bijvoorbeeld:

1. Salmonella/Campylobacter in kip en kipproducten.
2. E. coli = deze darmbacterie is te vinden bij een slechte hygiëne.
3. Staphylococcus aureus = huidbacterie die een hitte stabiel toxine produceert.

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Risicofactoren

• Import voedingsmiddelen vanuit landen met lage hygiëne
  
• Langdurige opslag en slecht bewaren
  
• Grote hoeveelheden aan maaltijden bereiden
  
• Verandering in eetgewoonten (minimaal behandelde k&k maaltijden, exotische gerechten)
  
• Gebrek aan kennis over hygiëne in keukens
  

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Hazard

Gevaren! Microbiologische, Chemische en Fysische gevaren

Analysis

Analyseren, onderzoeken

Critical Control Points

kritische stappen/punten in het proces die onder controle gehouden moeten worden om gevaar te voorkomen.

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

CONTROLE!

Microbiologische richtwaarden

Waarde (meestal een kiemgetal) waaraan een specifiek product moet voldoen om veilig te zijn voor de consument.

Indicator organismen

De aanwezigheid van een indicator-organisme toont aan, dat het waarschijnlijk is, dat er ook verwante micro-organismen aanwezig zijn. Deze zijn meestal pathogeen.

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Indicator-organismen

Als deze micro-organismen in grote hoeveelheden aanwezig zijn in een product (bv gehakt of drinkwater), is de kans groot dat er ook pathogene micro-organismen aanwezig zijn in het product. 

Waarom dan indicator- organismen aantonen?

• Pathogeen is vaak moeilijk aan te tonen
• In kleinere hoeveelheden en in tussenpozen aanwezig

uitleg a.d.h.v. voorbeeld

Wanneer E. coli aanwezig is, bestaat de mogelijkheid dat Salmonella ook aanwezig is. De redenering is dan dat er faecale besmetting is opgetreden, omdat E. coli een darmbacterie is. Beide bacteriën gebruiken namelijk dezelfde besmettingsweg.

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Voorwaarden aan het indicator- organisme

1. Zijn altijd in grote getale aanwezig wanneer het pathogeen aanwezig is.
2. Hebben een vergelijkbare besmettingswijze, groei en afsterving als het pathogeen.
3. Moet eenvoudig en snel aangetoond kunnen worden.

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Praktijk: Branchetaak kip 

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Indirecte telling/ kolonietelling

Methode 1: Spreidplaat

Berekening kiemgetal

Kolonies  *10 * Vf = KVE/ mL

KVE: kolonievormende eenheden

de suspensie wordt op de plaat verspreid

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Methode 2: Gietplaatmethode

De suspensie wordt door de agar gemengd

Berekening kiemgetal

Kolonies  * Vf = KVE/ mL

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Samenvatting kolonietelling

Kiemgetalberekening

Het aantal levende micro-organismen per milliliter of per gram.

1: 

Berekening: Kolonies * 10 * vf = KVE/mL

2:

 

Berekening: Kolonies  * vf = KVE/mL

Spreidplaatmethode

Gietplaatmethode

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Violet Red Bile Glucose agar

Selectieve stoffen

• Kristalviolet en galzouten remmen Gram positieven

Electieve stoffen

• Glucose en neutraalrood

Glucosefermentatie>zure producten>pH daalt>rode kolonies door neutraalrood + evt neerslag van galzouten

VRBG agar

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

Briljant Green Agar

Selectieve stoffen

• Briljant groen

Electieve stoffen

• Sacharose en lactose en fenolrood

Koolhydraat fermentatie >zure producten > pH daalt > gele kolonies/ plaat

• Bacteriën die de suikers niet fermenteren, breken aminozuren in het pepton af. Daardoor ontstaan basische producten > pH stijgt > rode kolonies/ plaat

BGA agar

P2.3 Basisanalist: Branchetaak kip

P2.3 Basisanalist: Moleculaire technieken

Techniek voor DNA vermenigvuldiging

PCR

Polymerase Chain Reaction

* Met deze techniek kan DNA / RNA worden vermenigvuldigd waardoor er genoeg DNA ontstaat om het DNA ook te kunnen analyseren. De vermenigvuldiging is hetzelfde als bij bacterien. 

Het aantal kopieen DNA neemt exponentieel toe. 

Link uitleg PCR: https://nl.wikipedia.org/wiki/Polymerasekettingreactie

Video exponentiele groei: https://youtu.be/d6p_M_7Qwjc

P2.3 Basisanalist: Moleculaire technieken

Praktische workflow PCR

P2.3 Basisanalist: Moleculaire technieken

Ingrediënten PCR reactie

Template DNA

Het te vermenigvuldigen DNA

• Bijvoorbeeld: E-coli

Buffer

Deze oplossing zorgt voor optimale omstandigheden voor het enzym:

• Zoutconcentratie
• Zuurgraad
• Bevat Mg²⁺. Mg²⁺ werkt als Cofactor voor het enzym Taq-polymerase

dNTP's

Dit zijn de nucleotiden. 

De monomeren van het nucleïnezuur DNA.

De 'N' kan een A, T, G of C zijn. 

Primers

Primers zijn kleine stukjes DNA van ongeveer 20-40 nucleotiden lang. 

Ze zijn specifiek voor het template DNA. 

In ons geval zijn ze speciaal voor E-coli ontworpen. 

Alleen op dat DNA kunnen ze annealen. 

Primers maken de reactie zeer specifiek. 

Voor elk type bacterie bestaan unieke primers. 

Taq- polymerase

Is het enzym dat nucleotiden middels een condensatie-reactie polymeriseert tot een nucleïnezuur (DNA) 

Dit DNA polymerase is 'hitte stabiel' omdat dit enzym is geïsoleerd uit een bacterie die leeft in een geiser (heet waterbron)

P2.3 Basisanalist: Moleculaire technieken

PCR vermenigvuldiging DNA

Progammeren

P2.3 Basisanalist: Moleculaire technieken

Agarose gel electroforese detectie/ analyse DNA

Agarose

Is het 'medium' waarin de scheiding plaatsvindt.

• Agarose is afkomstig uit zeewier.
• In 'vaste vorm' vormt zich een soort filter met poriën. 
• De grote van de poriën is afhankelijk van het percentage opgeloste agarose.
• De wijze van bereiding is gelijk aan dat van 'kweekmedium'.  

GelRed

Aan het DNA sample wordt GelRed toegevoegd.

Deze stof zorgt ervoor dat DNA onder een UV lamp zichtbaar wordt met het blote oog. 

De concentratie van GelRed is voor 1000x geconcentreerd. 

De eindconcentratie in het DNA monster moet 1x zijn.

Marker/ Ladder

De marker bevat DNA fragmenten van verschillende grootte. 

De grootte van die fragmenten is bekend. 

Door de scheiding die plaatsvindt onstaat er een soort ladder. 

De grootte van het DNA sample is vast te stellen door deze te vergelijken met die ladder. 

Loadingbuffer

Voor het electroforese proces wordt aan het DNA monster 'loadingbuffer' toegevoegd. Deze loadingbuffers zijn blauw of oranje van kleur.  

Toevoeging van deze buffer is noodzakelijk om 2 redenen.

1: Verzwaren van het DNA monster

2: Zichtbaar maken van de voortgang het electorforese proces. 

De kleurstof verplaatst zich sneller dan het kleinste fragment. 

Electroforese

Is een scheidingstechniek op basis van ladingsverschillen. 

(Deze scheidingstechniek lijkt op chromatografiek)

• DNA heeft een negatieve lading. Dit komt door de fosfaatgroepen aanwezig in de nucleotiden.  
• DNA moleculen verplaatsen daardoor in een elektrisch veld naar de positieve pool (anode)