Les 4 Cellijnen

• New lesson editor
• Biologie
• MBO
• Studiejaar 2

Week 4

Celkweek en medicijnen

Planning

• Filmpje bioprinten

• Inzetten celkweek monolayer

• Toepassingen cel- en weefselkweek vroeger en nu

• Verschillende celkweken

• Permanente cellijnen

Planning

• De cellen van Henriëtta Lacks

• HeLa cellen in het lab

• Celkweek laboratorium

• Laminaire flow werkkast

  • down-flow

• CO₂- incubator

• Omkeermicroscoop

• Celtellingen

• en verder......

Lesdoelen

Na deze les:

• kan je uitleggen in welke stappen de celkweek van een monolayer plaatsvindt.

• wat vroeger de toepassing was van celkweek en wat tegenwoordig

• kan je verschillende soorten celkweken opnoemen

• kan je de kenmerken van de soorten celkweken benoemen

• kan je concentraties van celsuspensies berekenen

• weet je wat HeLa cellen zijn;

• ken je diverse benodigdheden van een lab;

• weet je wat de kenmerken zijn van down-flowkast

De toekomst: Weefsels printen?

Video Bioprinten

00.24 - 2.29

3.56 - 6.23

8.38 - 12.45 (volumetrisch printen met laserlicht> hydrogel polymeriseert)

Toepassing van cel- en weefselkweek vroeger

In het begin twee toepassingen:

• cytologie > hoe ziet de cel eruit, hoe gedraagt de cel zich

• virologie > als gastheer voor productie van virusdeeltjes en voor diagnostiek.

Dit heeft geleid tot:

• ontdekking van vele virussoorten

• ontwikkeling van vaccins

(polio, mazelen, rode hond)

Sommige vogelvirussen worden nog gekweekt in eieren.

Patiënt: Henrietta Lacks

Onderzoeker: George Gey

HeLa cellen in onderzoek

• Stonden centraal in onderzoek naar kanker

  • Tegenwoordig worden er ook andere kanker cellijnen gebruikt, maar ook cellijnen die zijn “ontworpen”.

• Gebruikt voor de ontwikkeling van vaccins (polio, COVID-19)

• Gebruikt voor de identificatie van bepaalde virussen

  • Op basis van ziekmakend effect, dit wordt het cytopathologische effect (CPE) genoemd.

  • Voorbeelden van CPE: cellen die opzwellen, cellen die fuseren, multinucleatie.

Tegenwoordige toepassing

1. Kankeronderzoek. De gevoeligheid van tumorcellen en normale cellen voor chemotherapeutica wordt onderzocht.

2. Celfusie >hybridoma (productie specifieke ab's en kunnen oneindig delen) Hiermee kunnen monoclonale antistoffen worden gemaakt.

3. Cytotoxiciteits testen. Vooral voor het testen van cosmetica en ander producten die we op onze huid smeren.

4. Het produceren van vaccins.

5. (huid) Transplantaties. (zie filmpje bioprinting)

6. Vervanging gebruik van proefdieren

Verschillende celkweken

1. Primaire celkweek: verkregen vanuit weefsel, heterogeen celbeeld, doorzetten naar secundaire cultuur. Vaak beperkt mogelijk, vanwege veroudering en verlies van variatie (door overgroei)

2. Permanente cellijn: oneindig aantal passages, vaak getransformeerd (genetisch of maligne)

• Korte delingstijd (12-20 uur)

• Aantal chromosomen wijkt af/varieert (aneuploïdie vb. ontbreken chromosoom of heteroploïdie vb. bij trisomie 21)

• Mediumbehoefte nauwelijks specifiek

• Vertonen geen contactinhibitie (groeiremming als ze elkaar aanraken)

• Vertonen geen ruimtelijke oriëntatie (zoals in oorspronkelijke weefsel)

• Groeien vaak ook goed in suspensie

• Kunnen sterk verdund worden bij passage

Voorkeur voor permanente cellijn: homogene groei, grotere betrouwbaarheid op gebied van contaminaties

Celkweek

• Weefsel wordt verwijderd

• Cellen worden behandeld met trypsine > komen los te liggen

• Groeien in medium als suspensie of monolayer

• Bij voldoende confluentie (groei) worden de cellen doorgezet (passage) (+/- 70%)

Hoe hoger het passagenummer, des te meer kans op afwijkende cellen.

HeLa cellijn: epitheelachtig

• afkomstig van dekweefsel baarmoederhals

• vlak- en meerhoekig

• gehecht aan substraat(flesje)

HL-60 cellijn:

• Afkomstig van bloed: leukemie-cel

• Rond van vorm

• In suspensie

CA46 cellijn:

• B-cel tumorcel

• rond van cel

• in suspensie

Celkweek laboratorium

• Rustig gedeelte van het laboratorium

• Bij voorkeur alleen voor celkweek

• Afgesloten ruimte

• Voorkomen van luchtwervelingen

CO₂-incubator

Voor het kweken van cellen in flessen, platen of microtiterplaten wordt een CO₂-incubator met watermantel gebruikt.

De temperatuur van het water in de watermantel wordt voortdurend gemeten en op temperatuur gehouden. De temperatuur in de incubator is constant.

Kweken bij 5% CO₂ is gebruikelijk. De CO2 concentratie wordt voortdurend gemeten en op het ingestelde niveau gehouden. De buffer van het kweekmedium houdt, samen met het CO2-gehalte, de pH van het kweekmedium constant.

De atmosfeer in de incubator wordt controleerbaar gehouden door een hoge luchtvochtigheid. De luchtvochtigheid wordt voortdurend gemeten en op het ingestelde niveau gehouden.

Laminair flow werkkast

Een LAF-kast heeft een luchtstroom die via een filter (high efficiency particulate air, HEPA of ultra low particulate air, ULPA) op het werkblad komt. Het is een unidirectionele luchtstroom, dus een luchtstroom in één richting.

Type LAF-kasten:

• Cross-flow

• Down-flow

LAF-kast: down-flow (vertical flow)

In een down-flow kast stroomt de gefilterde lucht van boven in de richting van het werkblad: een verticale luchtstroom.

Kenmerken

• Materiaal en analist worden beschermd

• Verschillende veiligheidklassen.

• bijna gesloten front, met net genoeg ruimte om te werken.

• Te gebruiken bij het werken met: pathogenen (klasse II of hoger), virussen, menselijk en dierlijk materiaal, primaire- en diploïde cellen, niet gekarakteriseerde cellen.

LAF-kast: down-flow (vertical flow)

De luchtstroom in een down-flow kast ondervindt geen problemen als er met grotere apparatuur in wordt gewerkt.

De analist moet er zorg voor dragen niet boven het materiaal te werken. Besmettingen kunnen vanaf boven het werkveld bereiken.

Plastics

Voor de celkweek volstaat het niet om te werken met “gewone” steriele plastic flessen. Plastics worden aangeduid met “culture treated” wanneer ze geschikt zijn voor de celkweek. Deze flessen mag je nooit bij de hals vastpakken i.v.m. contaminatiegevaar

Deze plastics zijn gemaakt van hoogwaardig polystyreen, vrij van detecteerbare DNases, RNases, menselijk DNA en endotoxinen. De plastics zijn niet-cytotoxisch.

Voor grotere hoeveelheden worden ook wel rollerbottles gebruikt. Speciale apparatuur houdt ze in beweging.

Omkeermicroscoop

Cellen worden iedere dag of om de dag bekeken:

• De morfologie bestudeerd

• Er wordt gecontroleerd op besmettingen of ongunstige omstandigheden in het kweekmedium (kleur medium, troebeling medium, besmetting).

M.b.v. de omkeermicroscoop wordt de confluentie van de cellen bepaald (gedeelte van het oppervlak waar zich cellen aan hebben gehecht).

Telkamer

Telkamer

• Met de telkamer kun je de celconcentratie van je celkweek bepalen

• vooral belangrijk bij suspensiecellen

• of aan het einde vd kweek, bij het oogsten

• rekenregels: zie 'bron telkamer' op IL

En wat nog meer…

• Koel- en vrieskasten:

  • Media wordt bewaard bij 4 °C.

  • Stockoplossingen van bijvoorbeeld glutamine, antibiotica en serum worden opgeslagen bij -20 °C.

  • Virussen worden bewaard bij -70 °C.

  • Cellijnen worden bewaard door ze in te vriezen in vloeibare stikstof (-196 °C ).

• Centrifuge:

  • Wassen of concentreren van gekweekte cellen bij lage g-waarden.

• Waterbad:

  • Opwarmen van o.a. te gebruiken media. Zo kunnen cellen vanuit de incubator overgebracht worden in media met dezelfde temperatuur.

Wat is het verschil tussen een monolayer en een suspensie?

Waarom voeg je na de trypsinebehandeling meteen medium toe?

A

Om trypsine te deactiveren

B

Om te voorkomen dat cellen gaan klonteren

C

Om besmetting te voorkomen

D

Om ervoor te zorgen dat de cellen beter hechten

Hoe kan je zien dat je kweek besmet is?

De kleur van het medium in de kweekbakjes zegt iets over:

A

De hoeveelheid gekweekte cellen

B

De temperatuur in het medium

C

De pH van het medium

D

Eventuele besmetting van de kweek

Wat is waar?

I Cellen worden ingevroren bij -196^oC, omdat dan de kans op stukgaan kleiner is.

II Door cellen bij -196^oC in te vriezen veroudert de cel niet.

A

Alleen I is waar

B

Alleen II is waar

C

I en II zijn beide waar

D

I en II zijn beide niet waar

Vragen?

Weekopdracht

Jullie gaan een tutorial opnemen over 1 vd volgende werkzaamheden:

1. de werking van en werken in de LAF-kast

2. het kweken van HeLa cellen

3. het kweken van CA46 cellen

4. het gebruik van de telkamer

maak duo's of trio's en verdeel bovenstaande onderwerpen

kijk goed in de bijgeleverde uitleg aan welke eisen het filmpje moet voldoen.

vrijdag laten jullie elkaar het filmpje zien en leveren het in op IL