P2.2 BIOT Moleculaire technieken

• Biologie
• MBO
• Studiejaar 2

P2.1 Basisanalist: Moleculaire technieken

Moleculaire technieken

Bronnen

• BIOP 2.2 basis: kwaliteit leveren 

Thema "Moleculaire technieken"

Opdracht 

moleculaire technieken

https://nl.wikipedia.org/wiki/Moleculaire_biologie

• Biomoleculen: Nucelïnezuren, Eiwitten, Vetten
• Enzymen
• Polymerase ketting reactie
• DNA electroforese 

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Welk type nucleïnezuren ken je?

DNA: DeoxyriboNucleïc Acid(= zuur)

• De pentose in DNA is: Deoxyribose

RNA: RiboNucleïc Acid 

• De pentose in RNA is: Ribose

Welk type vetten ken je?

1: Tryglyceriden

2: Fosfolipiden

3: Steroïden

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Nucleïnezuren

Algemeen

• Opgebouwd uit 
• Vooral aanwezig in de celkern
• Bevat de code van onze 'erfelijke informatie'
• 2 vormen nucleïnezuren

• Het zijn polymeren van nucleotiden

Nucleotiden

Nucleotiden zijn opgebouwd uit 3 onderdelen.

1. Stikstofbase
2. Monosacharide (pentose)
3. Fosfaat- groep

RNA

Afkorting van het Engelse woord: Ribonucleïc acid

In het Nederlands: Ribonucleïnezuur.

• De pentose in RNA is: Ribose

DNA

Afkorting van het Engelse woord: Deoxyribonucleïc acid

In het Nederlands: Deoxyribonucleïnezuur.

• De pentose in DNA is: Deoxyribose

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Verschillen tussen RNA en DNA

RNA

• 4 mogelijke stikstofbasen: 
• Uracil (U), Adenine (A), Guanine (G) en Cytosine (C)
• Het polymeer is 'enkelstrengs'. 
• Bevat ribose

DNA

• 4 mogelijke stikstofbasen:  Thymine (T), Adenine (A), Guanine (G) en Cytosine (C)
• Bevat deoxiribose
• Het polymeer is 'dubbelstrengs'
• De basen A-T en G-C vormen 'Basenparen (bp)' 
• De 'treden' van de dubbele DNA wenteltrap.
• De dubbele strengen zijn 'complementair'. 

• Nucleïnezuren ontstaan door polymerisatie van nucleotiden
• Polymerisatie middels 

Condensatie-reactie

Chemische reactie waarbij het polymeer ontstaat door aaneenschakeling van monomeren

Bij deze reactie komt water vrij

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Vetten

Fosfolipiden

Zijn opgebouwd uit:

• Glycerol + 2 vetzuren + fosfaat
• Hydrofiele kop + hydrofobe staart
  
• Bouwstenen celmembraan

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

In water keren de staarten naar elkaar toe

Celmembraan

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

2 lagen fosfolipiden

P2.1 Basisanalist: Moleculaire technieken

Celtypen en celgrootte 

Welk type cellen zijn hier afgebeeld?

Links: een eukaryote cel

Rechts: een prokaryote cel

Wat is het verschil tussen dit type cel?

Eukaryote cellen zijn:

* Groter

* Hebben een celkern

* Zijn gespecialiseerder (meer organellen)

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Verschillende celtypen hebben een andere bouw waardoor de DNA isolatie procedure niet gelijk is.  

Invloed celtypen op DNA isolatie 

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Technieken om celbarrieres te breken

* Enzymatishe afbraak van celwanden

* Afbraak van celmembranen m.b.v. detergentia (zeep-oplossingen)

* Osmotische shock zodat cellen knappen

* Herhaaldelijk invriezen en ontdooien

Technieken om celresten te scheiden van DNA

* Filtratie

* Centrifugatie

* Zoutprecipitatie (neerslaan)

* DNA precipitatie met ijskoude Alcohol

DNA isolatie en zuiveringstechnieken

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Techniek voor DNA vermenigvuldiging

PCR

Polymerase Chain Reaction

* Met deze techniek kan DNA / RNA worden vermenigvuldigd waardoor er genoeg DNA ontstaat om het DNA ook te kunnen analyseren. De vermenigvuldiging is hetzelfde als bij bacterien. 

Het aantal kopieen DNA neemt exponentieel toe. 

Link uitleg PCR: https://nl.wikipedia.org/wiki/Polymerasekettingreactie

Video exponentiele groei: https://youtu.be/d6p_M_7Qwjc

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Praktische workflow PCR

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Ingrediënten PCR reactie

Template DNA

Het te vermenigvuldigen DNA

• Bijvoorbeeld: E-coli

Buffer

Deze oplossing zorgt voor optimale omstandigheden voor het enzym:

• Zoutconcentratie
• Zuurgraad
• Bevat Mg²⁺. Mg²⁺ werkt als Cofactor voor het enzym Taq-polymerase

dNTP's

Dit zijn de nucleotiden. 

De monomeren van het nucleïnezuur DNA.

De 'N' kan een A, T, G of C zijn. 

Primers

Primers zijn kleine stukjes DNA van ongeveer 20-40 nucleotiden lang. 

Ze zijn specifiek voor het template DNA. 

In ons geval zijn ze speciaal voor E-coli ontworpen. 

Alleen op dat DNA kunnen ze annealen. 

Primers maken de reactie zeer specifiek. 

Voor elk type bacterie bestaan unieke primers. 

Taq- polymerase

Is het enzym dat nucleotiden middels een condensatie-reactie polymeriseert tot een nucleïnezuur (DNA) 

Dit DNA polymerase is 'hitte stabiel' omdat dit enzym is geïsoleerd uit een bacterie die leeft in een geiser (heet waterbron)

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

PCR vermenigvuldiging DNA

Progammeren

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Agarose gel electroforese detectie/ analyse DNA

Agarose

Is het 'medium' waarin de scheiding plaatsvindt.

• Agarose is afkomstig uit zeewier.
• In 'vaste vorm' vormt zich een soort filter met poriën. 
• De grote van de poriën is afhankelijk van het percentage opgeloste agarose.
• De wijze van bereiding is gelijk aan dat van 'kweekmedium'.  

GelRed

Aan het DNA sample wordt GelRed toegevoegd.

Deze stof zorgt ervoor dat DNA onder een UV lamp zichtbaar wordt met het blote oog. 

De concentratie van GelRed is voor 1000x geconcentreerd. 

De eindconcentratie in het DNA monster moet 1x zijn.

Marker/ Ladder

De marker bevat DNA fragmenten van verschillende grootte. 

De grootte van die fragmenten is bekend. 

Door de scheiding die plaatsvindt onstaat er een soort ladder. 

De grootte van het DNA sample is vast te stellen door deze te vergelijken met die ladder. 

Loadingbuffer

Voor het electroforese proces wordt aan het DNA monster 'loadingbuffer' toegevoegd. Deze loadingbuffers zijn blauw of oranje van kleur.  

Toevoeging van deze buffer is noodzakelijk om 2 redenen.

1: Verzwaren van het DNA monster

2: Zichtbaar maken van de voortgang het electorforese proces. 

De kleurstof verplaatst zich sneller dan het kleinste fragment. 

Electroforese

Is een scheidingstechniek op basis van ladingsverschillen. 

(Deze scheidingstechniek lijkt op chromatografiek)

• DNA heeft een negatieve lading. Dit komt door de fosfaatgroepen aanwezig in de nucleotiden.  
• DNA moleculen verplaatsen daardoor in een elektrisch veld naar de positieve pool (anode)