P2.2 BIOT Moleculaire technieken

• Biologie
• MBO
• Studiejaar 2

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Moleculaire technieken

Bronnen

• BIOP 2.2 basis: kwaliteit leveren 

Thema "Moleculaire technieken"

Opdracht 

moleculaire technieken

<a href="https://nl.wikipedia.org/wiki/Moleculaire_biologie">https://nl.wikipedia.org/wiki/Moleculaire_biologie</a><div><div><ul><li>Biomoleculen: Nucelïnezuren, Eiwitten, Vetten</li><li>Enzymen</li><li>Polymerase ketting reactie</li><li>DNA electroforese&nbsp;</li></ul></div></div>

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Welk type nucleïnezuren ken je?

DNA: <b style="color: rgb(236, 72, 77)">D</b>eoxyribo<span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: 700">N</span>ucleïc <span style="font-weight: bold; color: rgb(236, 72, 77)">A</span>cid(= zuur)<div><ul><li>De pentose in DNA is: <span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">Deoxyribose</span></li></ul><div><br></div><div>RNA: <b style="color: rgb(236, 72, 77)">R</b>ibo<span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: 700">N</span>ucleïc <span style="font-weight: bold; color: rgb(236, 72, 77)">A</span>cid&nbsp;</div><div><ul><li>De pentose in RNA is:&nbsp;<span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">Ribose</span></li></ul></div></div>

Welk type vetten ken je?

1: Tryglyceriden<div><br></div><div>2: Fosfolipiden</div><div><br></div><div>3: Steroïden</div>

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Nucleïnezuren

Algemeen

• Opgebouwd uit 
• Vooral aanwezig in de celkern
• Bevat de code van onze 'erfelijke informatie'
• 2 vormen nucleïnezuren

• Het zijn polymeren van nucleotiden

Nucleotiden

Nucleotiden zijn opgebouwd uit 3 onderdelen.<div><ol><li>Stikstofbase</li><li>Monosacharide (pentose)</li><li>Fosfaat- groep</li></ol></div>

RNA

Afkorting van het Engelse woord: <span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">R</span>ibo<span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">n</span>ucleïc <span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">a</span>cid<div>In het Nederlands: Ribonucleïnezuur.</div><div><br></div><div><ul><li>De pentose in RNA is: <span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">Ribose</span></li></ul></div>

DNA

Afkorting van het Engelse woord: <span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">D</span>eoxyribo<span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">n</span>ucleïc <span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">a</span>cid<div>In het Nederlands: Deoxyribonucleïnezuur.</div><div><ul><li>De pentose in DNA is: <span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">Deoxyribose</span></li></ul></div>

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Verschillen tussen RNA en DNA

RNA

<ul><li>4 mogelijke stikstofbasen:&nbsp;
</li><li><span style="font-weight: bold; color: rgb(236, 72, 77)">Uracil (U)</span>, Adenine (A), Guanine (G) en Cytosine (C)</li><li>Het polymeer is 'enkelstrengs'.&nbsp;
</li><li>Bevat ribose</li></ul><div><br></div>

DNA

<ul><li>4 mogelijke stikstofbasen:&nbsp; <span style="color: rgb(236, 72, 77)">Thymine (T)</span>, Adenine (A), Guanine (G) en Cytosine (C)</li><li>Bevat deoxiribose</li><li>Het polymeer is 'dubbelstrengs'
</li><li>De basen A-T en G-C vormen 'Basenparen (bp)'&nbsp;</li><li>De 'treden' van de dubbele DNA wenteltrap.</li><li>De dubbele strengen zijn 'complementair'.&nbsp;
</li></ul><div></div><div><br></div>

• Nucleïnezuren ontstaan door polymerisatie van nucleotiden
• Polymerisatie middels 

Condensatie-reactie

Chemische reactie waarbij het polymeer ontstaat door aaneenschakeling van monomeren
<div>Bij deze reactie komt&nbsp;water&nbsp;vrij
</div><div><br></div>

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Vetten

Fosfolipiden

Zijn opgebouwd uit:

• Glycerol + 2 vetzuren + fosfaat
• Hydrofiele kop + hydrofobe staart
  
• Bouwstenen celmembraan

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

In water keren de staarten naar elkaar toe

Celmembraan

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

2 lagen fosfolipiden

P2.1 Basisanalist: Moleculaire technieken

Celtypen en celgrootte 

Welk type cellen zijn hier afgebeeld?

Links: een eukaryote cel<div>Rechts: een prokaryote cel</div>

Wat is het verschil tussen dit type cel?

Eukaryote cellen zijn:<div>* Groter</div><div>* Hebben een celkern</div><div>* Zijn gespecialiseerder (meer organellen)</div>

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Verschillende celtypen hebben een andere bouw waardoor de DNA isolatie procedure niet gelijk is.  

Invloed celtypen op DNA isolatie 

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Technieken om celbarrieres te breken

* Enzymatishe afbraak van celwanden<div>* Afbraak van celmembranen m.b.v. detergentia (zeep-oplossingen)</div><div>* Osmotische shock zodat cellen knappen</div><div>* Herhaaldelijk invriezen en ontdooien</div>

Technieken om celresten te scheiden van DNA

* Filtratie<div>* Centrifugatie</div><div>* Zout<u>precipitatie</u> (neerslaan)</div><div>* DNA precipitatie met ijskoude Alcohol</div>

DNA isolatie en zuiveringstechnieken

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Techniek voor DNA vermenigvuldiging

PCR

<b style="color: rgb(236, 72, 77)">P</b>olymerase <span style="font-weight: bold; color: rgb(236, 72, 77)">C</span>hain <span style="font-weight: bold; color: rgb(236, 72, 77)">R</span>eaction<div>* Met deze techniek kan DNA / RNA worden vermenigvuldigd waardoor er genoeg DNA ontstaat om het DNA ook te kunnen analyseren. De vermenigvuldiging is hetzelfde als bij bacterien.&nbsp;</div><div>Het aantal kopieen DNA neemt <span style="font-weight: bold">exponentieel</span> toe.&nbsp;</div><div><br></div><div>Link uitleg PCR:&nbsp;<a href="https://nl.wikipedia.org/wiki/Polymerasekettingreactie">https://nl.wikipedia.org/wiki/Polymerasekettingreactie</a></div><div>Video exponentiele groei:&nbsp;<a href="https://youtu.be/d6p_M_7Qwjc">https://youtu.be/d6p_M_7Qwjc</a><br></div><div><br></div>

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Praktische workflow PCR

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Ingrediënten PCR reactie

Template DNA

Het te vermenigvuldigen DNA<br><div><ul><li>Bijvoorbeeld: E-coli</li></ul></div>

Buffer

Deze oplossing zorgt voor optimale omstandigheden voor het enzym:<div><div><ul><li>Zoutconcentratie</li><li>Zuurgraad</li><li><span style="font-weight: bold; color: rgb(236, 72, 77)">Bevat Mg²⁺.</span> <span style="color: rgb(236, 72, 77); font-weight: bold">Mg²⁺&nbsp;werkt als Cofactor voor het enzym <span style="font-style: italic">Taq-polymerase</span></span></li></ul></div></div>

dNTP's

Dit zijn de <u>nucleotiden</u>.&nbsp;<div>De monomeren van het nucleïnezuur DNA.<div>De 'N' kan een A, T, G of C zijn.&nbsp;</div></div>

Primers

Primers zijn kleine stukjes DNA van ongeveer 20-40 nucleotiden lang.&nbsp;<div>Ze zijn specifiek voor het template DNA.&nbsp;</div><div>In ons geval zijn ze speciaal voor E-coli ontworpen.&nbsp;</div><div>Alleen op dat DNA kunnen ze annealen.&nbsp;</div><div><br></div><div>Primers maken de reactie zeer specifiek.&nbsp;</div><div>Voor elk type bacterie bestaan unieke primers.&nbsp;</div>

Taq- polymerase

Is het enzym dat nucleotiden middels een condensatie-reactie polymeriseert tot een nucleïnezuur (DNA)&nbsp;<div><br></div><div>Dit DNA polymerase is 'hitte stabiel' omdat dit enzym is geïsoleerd uit een bacterie die leeft in een geiser (heet waterbron)</div>

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

PCR vermenigvuldiging DNA

Progammeren

P2.2 Basisanalist: Moleculaire technieken

Agarose gel electroforese detectie/ analyse DNA

Agarose

Is het 'medium' waarin de scheiding plaatsvindt.<div><ul><li>Agarose is afkomstig uit zeewier.</li><li>In 'vaste vorm' vormt zich een soort filter met poriën.&nbsp;</li><li>De grote van de poriën is afhankelijk van het percentage opgeloste agarose.</li><li>De wijze van bereiding is gelijk aan dat van 'kweekmedium'.&nbsp;&nbsp;</li></ul></div>

GelRed

Aan het DNA sample wordt GelRed toegevoegd.<div>Deze stof zorgt ervoor dat DNA onder een UV lamp zichtbaar wordt met het blote oog.&nbsp;</div><div><br></div><div>De concentratie van GelRed is voor 1000x geconcentreerd.&nbsp;</div><div>De eindconcentratie in het DNA monster moet 1x zijn.</div><div><br></div>

Marker/ Ladder

De marker bevat DNA fragmenten van verschillende grootte.&nbsp;<div>De grootte van die fragmenten is bekend.&nbsp;</div><div><br><div>Door de scheiding die plaatsvindt onstaat er een soort ladder.&nbsp;</div></div><div>De grootte van het DNA sample is vast te stellen door deze te vergelijken met die ladder.&nbsp;</div>

Loadingbuffer

Voor het electroforese proces wordt aan het DNA monster 'loadingbuffer' toegevoegd. Deze loadingbuffers zijn blauw of oranje van kleur.&nbsp;&nbsp;<div><br><div>Toevoeging van deze buffer is noodzakelijk om 2 redenen.<div>1: Verzwaren van het DNA monster</div><div>2: Zichtbaar maken van de voortgang het electorforese proces.&nbsp;</div></div><div>De kleurstof verplaatst zich sneller dan het kleinste fragment.&nbsp;</div></div>

Electroforese

Is een scheidingstechniek op basis van ladingsverschillen.&nbsp;<div>(Deze scheidingstechniek lijkt op chromatografiek)<br><div><br></div><div><ul><li>DNA heeft een negatieve lading. Dit komt door de fosfaatgroepen aanwezig in de nucleotiden.&nbsp;&nbsp;</li><li>DNA moleculen verplaatsen daardoor in een elektrisch veld naar de positieve pool (anode)</li></ul></div><div><div><br></div></div></div>