Les 4 - do 24 sept

• New lesson editor
• Biologie
• MBO
• Studiejaar 2

DONDERDAG

Praktijkvoorbereiding

Levensmiddelenindustrie · microbiologie

Bonte rij · S. aureus · Pseudomonas

LEERDOELEN

Aan het einde van de praktijkles kun je…

Doel 1

De bonte rij aflezen en uitwerken, en met de determinatietabel controleren of je test klopt.

Doel 2

De platen van de eiersalade beoordelen en verdachte kolonies bevestigen met gramkleuring, katalase, coagulase en DNAse.

Doel 3

Indol, citraat, ureum, oxidase en katalase correct uitvoeren en de uitslag noteren.

Doel 4

Experiment 9 inzetten: verdunningen maken en spreidplaten uitstrijken voor Pseudomonas aeruginosa in water.

2

PROGRAMMA

Planning op donderdag

1

Bonte rij aflezen

Experiment 5 · glucose, lactose, sacharose en Kligler-buis

AFLEZEN

2

Platen aflezen

Experiment 7 · S. aureus in eiersalade en de bevestigingstesten

AFLEZEN + ENTEN

3

Bonte rij, deel 2

Experiment 6 · indol, citraat, ureum, oxidase en katalase

INZETTEN

4

Experiment 9 inzetten

Pseudomonas aeruginosa in water · verdunningen en spreidplaten

INZETTEN

3

EXP 5 · BONTE RIJ AFLEZEN

Wat ga je doen?

1

Lees de suikerbuisjes af: glucose, lactose en sacharose (kleur en gas in het Durham-buisje).

2

Lees de Kligler-buizen af: schuine deel, bodem, gas en H2S.

3

Vul je uitwerkingstabellen in: tabel 5.1 en 5.2, met een opmerking of conclusie per bacterie.

4

Controleer met de determinatietabel (tabel 5.3): klopt jouw test met de verwachte uitslag?

Belangrijk: vul eerst je eigen resultaten in. Gebruik daarna de determinatietabel om te controleren of jouw test klopt.

4

1 · BONTE RIJ AFLEZEN

Suikerbuisjes aflezen

Rood

Geen omslag

Geel

Zuur gevormd

Geel + bel

Zuur en gas

−

+

+ gas

Zuurvorming: de indicator kleurt om. Bij fenolrood van rood naar geel.

Gas: een luchtbel in het omgekeerde Durham-buisje.

Per bacterie drie buisjes: glucose, lactose, sacharose.

Noteer + of − in tabel 5.1, gas bij de opmerking.

5

1 · BONTE RIJ AFLEZEN

Kligler-buis aflezen

1

Niet-beënte buis (lichtrood).

2

Hele buis geel: lactose (en glucose) omgezet, bijv. E. coli.

3

Bellen of scheuren: gasvorming (E. coli, Klebsiella).

4

Rode top, gele bodem: alleen glucose (bijv. Shigella).

5

Rode top, zwarte bodem: H2S (bijv. Salmonella).

Tabel 5.2: schuine deel = lactose, bodem = glucose. Alleen zwart, zonder geel? Dan is H2S toch positief.

6

1 · BONTE RIJ AFLEZEN

Uitwerken: tabel 5.1 en 5.2

Tabel 5.1 · Eigen resultaten bonte rij

Tabel 5.2 · Eigen resultaten Kligler-buis

7

1 · BONTE RIJ AFLEZEN

Klopt jouw test? Tabel 5.3

Dit is je determinatietabel. Vergelijk je eigen tabel 5.1 en 5.2 met de verwachte uitslag hierboven. Wijkt een test af? Noteer welke test afwijkt en geef een mogelijke verklaring, bijvoorbeeld te weinig geënt, verontreiniging of te kort geïncubeerd.

8

Een Kligler-buis heeft een rode top en een gele bodem, zonder zwarte neerslag en zonder gasbellen. Wat concludeer je?

A

Glucose én lactose worden gefermenteerd

B

Alleen glucose wordt gefermenteerd

C

Er wordt geen suiker gefermenteerd

D

De bacterie vormt H₂S

EXP 7 · PLATEN AFLEZEN

Eiersalade: S. aureus aflezen

1

Tel de verdachte kolonies op de BP-platen. Typisch: zwarte, glanzende kolonies met een heldere zone eromheen. Overleg met je labpartner. Noteer de KVE/gram -> is dit boven of onder de norm?

2

Kies twee verdachte kolonies voor de bevestiging.

3

Voer met beide kolonies vier testen uit (zie hieronder). Bij S. aureus verwacht je Gram-positieve coccen.

S. aureus op BP-agar

Vier bevestigingstesten per kolonie

Gramkleuring

Katalase

Coagulase

DNAse-plaat

11

EXP 7 · PLATEN AFLEZEN

Test 1 · Gramkleuring

1

Uitstrijkje maken: suspendeer een beetje van de kolonie in een druppel water op een objectglas en smeer dun uit.

2

Drogen en fixeren: laat aan de lucht drogen, trek daarna kort door de vlam.

3

Kristalviolet 1 min, afspoelen met water.

4

Lugol 1 min, afspoelen.

5

Ontkleuren met alcohol (10–20 s), direct afspoelen.

6

Safranine 1 min, afspoelen en droogdeppen.

7

Microscoop: bekijk met immersieolie (100× objectief).

Gram-positieve coccen (afb. 7.1)

Paars

Gram-positief

Roze

Gram-negatief

12

EXP 7 · PLATEN AFLEZEN

Test 2 · Katalase

1

Doe één druppel 3% waterstofperoxide (H2O2) op een objectglaasje.

2

Neem met een entnaald een beetje van de kolonie.

3

Suspendeer de kolonie in de druppel.

4

Kijk direct: gasbelletjes = positief, geen belletjes = negatief.

Positief

belletjes

Negatief

glad druppeltje

Waarom belletjes? Katalase breekt H2O2 af tot water en zuurstof. Het zuurstofgas zie je als belletjes. Doe de test voor beide kolonies. S. aureus is katalase-positief.

13

Je suspendeert een kolonie in een druppel 3% H₂O₂ en er ontstaan direct gasbelletjes. Wat betekent dit?

A

Katalase-positief; het gas is zuurstof

B

Katalase-negatief; het gas is CO₂

C

Katalase-positief; het gas is CO₂

D

Oxidase-positief; het gas is waterstof

EXP 7 · PLATEN AFLEZEN

Test 3 · Coagulase

1

Twee druppels op een objectglaasje: één met plasma en één met fysiologisch zout (controle).

2

Suspendeer een kolonie in elke druppel en meng goed.

3

Kijk naar de plasmadruppel: samenklontering = positief; een homogene suspensie is negatief.

4

De zoutcontrole moet negatief zijn. Klontert die ook, dan is het auto-agglutinatie en is de test ongeldig.

Positief

klonters in plasma

Negatief

homogeen

Waarom coagulase? S. aureus stolt plasma. S. epidermidis is coagulase-negatief, dus je onderscheidt ze hiermee. Doe de test voor beide kolonies.

16

Wat zie je bij een positieve coagulasetest, en waarom doe je ook een controle met fysiologisch zout?

EXP 7 · PLATEN AFLEZEN

Test 4 · DNAse-plaat enten

1

Werk aseptisch in de flowkast en label de plaat: kolonie 1 en 2, datum, groep.

2

Ent een kwart (¼) van de DNAse-plaat met de kolonie: een gevulde ronde ter grootte van een 10-centmunt.

3

Ent de tweede kolonie op een ander kwart.

4

Incubeer 20–24 uur bij 37 °C.

Vandaag

kolonie enten

Volgende les

na 1 M HCl

Volgende les: overgieten met 1 M HCl, minstens een kwartier laten intrekken. Een heldere zone rond de kolonie is DNAse-positief. Bekijk de plaat op een donkere ondergrond.

19

EXP 7 · PLATEN AFLEZEN

Is het S. aureus? Tabel 7.1

Gram-positieve coccen

verwacht je bij S. aureus én S. epidermidis.

Zo trek je je conclusie: noteer per kolonie je uitslagen in een overzichtelijke tabel en vergelijk met tabel 7.1.

20

EXP 6 · BONTE RIJ DEEL 2

Exp. 6 Bonte rij deel 2: Vijf extra testen

De vier stammen

Klebsiella pneumoniae

Salmonella Paratyphi B

E. coli HB101

Pseudomonas aeruginosa

21

EXP 6 · BONTE RIJ DEEL 2

Voorbereiden en enten

Flowkast

Klebsiella pneumoniae Salmonella Paratyphi B Pseudomonas aeruginosa

Steriele wegwerp-naald, niet flamberen.

Labtafel

E. coli HB101

Metalen naald: flamberen vóór én na elk gebruik en de hals van het buisje flamberen.

Per bacterie drie buisjes: tryptofaanbouillon (indol), citraatagar en ureumagar. Label vooraf met bacterie, test, datum en naam. Oxidase en katalase doe je direct op een kolonie van een verse plaat.

22

EXP 6 · BONTE RIJ DEEL 2

Indol: tryptofaanbouillon

1

Neem een beetje van de kolonie met de entnaald.

2

Ent de bouillon: beweeg de naald door de vloeistof en sluit de buis aseptisch.

3

Incubeer minstens 24 uur bij 37 °C.

4

Volgende les, in de zuurkast: voeg enkele druppels Kovacs' reagens toe. Een rode laag = positief.

Negatief

blijft geel

Positief

rode laag

23

EXP 6 · BONTE RIJ DEEL 2

Citraat: citraatagar

1

Neem een beetje van de kolonie met de entnaald.

2

Ent alleen het oppervlak: een zigzag-streep over de schuine agar. Geen steek.

3

Incubeer minstens 24 uur bij 37 °C, buis rechtop.

4

Volgende les: lees af. Groei met een kleuromslag = positief.

Negatief

blijft groen

Positief

blauw

24

EXP 6 · BONTE RIJ DEEL 2

Ureum: ureumagar

1

Neem een beetje van de kolonie met de entnaald.

2

Ent alleen het oppervlak, net als bij citraat: zigzag over de schuine agar.

3

Incubeer minstens 24 uur bij 37 °C.

4

Volgende les: urease breekt ureum af tot ammoniak. De pH stijgt en de agar kleurt roze = positief.

25

EXP 6 · BONTE RIJ DEEL 2

Oxidase: oxidasestrip

1

Pak een oxidasestrip uit de koelkast.

2

Neem een beetje kolonie van een verse plaat, bij voorkeur met een kunststof of wegwerp-ent.

3

Smeer uit op het filtergedeelte van de strip.

4

Wacht maximaal 10 seconden: violet of diepblauw = positief, geen kleur = negatief.

5

Noteer direct de uitslag in tabel 6.1.

Positief

Negatief

filtergedeelte

26

EXP 6 · BONTE RIJ DEEL 2

Katalase: op een kolonie

1

Druppel 3% H₂O₂ op een objectglaasje.

2

Neem een beetje kolonie met de entnaald.

3

Resuspendeer de kolonie in de druppel.

4

Gasbelletjes = positief: de bacterie heeft het enzym katalase.

5

Noteer direct de uitslag in tabel 6.1.

Positief

Negatief

Zelfde test als bij de eiersalade

Verwacht: alle vier de stammen zijn katalase-positief (tabel 6.2). Toch testen: zo controleer je je uitvoering.

27

Sleep de juiste test uitslag naar de juiste buis.

Katalase positief

Indolpositief

Katalase negatief

Oxidase negatief

Oxidase positief

Urease positief

EXP 6 · BONTE RIJ DEEL 2

Volgende les: alles combineren

Dag 2: lees citraat en ureum af, voeg in de zuurkast Kovacs' reagens toe voor indol, en noteer alles in tabel 6.1. Vergelijk je uitslagen van beide bonte rijen met deze tabel. Wijkt een test af? Geef aan welke en noem een mogelijke verklaring.

30

EXPERIMENT 9 INZETTEN

Exp. 9: Pseudomonas aeruginosa in water

Gram-negatieve, aerobe staaf in aarde en water. In drinkwater hoort P. aeruginosa afwezig te zijn.

Groeit ook bij lage temperaturen en kan zo bederf van gekoelde producten veroorzaken.

Voorbereiden: zoek de norm voor P. aeruginosa in water op.

P. aeruginosa op cetrimide-agar

Dag 1 · vandaag

inzetten

Dag 2

tellen en bevestigen

Dag 3

aflezen en berekenen

31

EXPERIMENT 9 INZETTEN

Stap 1 · Verdunningen maken

Monster

A of B

9 mL pfz

10-1

0,1 mL

9 mL pfz

10-2

0,1 mL

9 mL pfz

10-3

0,1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

MH-platen

1

Label eerst alle buisjes en platen (monster, verdunning, datum, groep).

2

1 mL monster in 9 mL pfz: mengen. Daarna steeds 1 mL doorpipetteren. Nieuwe tip per stap.

3

Doe dit voor monster A én B: 6 buisjes pfz, 6 MH-platen.

32

EXPERIMENT 9 INZETTEN

Stap 2 · Uitstrijken en incuberen

1

Pipetteer 0,1 mL van elke verdunning op een MH-plaat.

2

Verdeel met een steriele Drigalski-spatel over de plaat tot het vocht is opgenomen.

3

Incubeer 24 uur bij 37 °C.

4

Ruim op: spatel en tips in de afvalbak, werkplek reinigen.

0,1 mL

33

Moet Pseudomonas wel of niet in de flowkast?

A

Wel

B

Niet

C

Answer C

D

Answer D

Aan de slag!

Maak de voorbereidende vraag van experiment 9.

Klaar? Zet de platen van exp. 7 (eiersalade experiment) terug in de stoof op 37 C!

Nog eens klaar? Kijk de opdrachten na van de vorige theorieles van microbiologie (selectieve/electieve media)

Donderdag: checklist

Tabel 5.1 en 5.2 ingevuld en vergeleken met tabel 5.3

Exp. 7: S. aureus: gramkleuring, katalase en coagulase genoteerd

DNAse-platen geënt en gelabeld

Bonte rij deel 2 geënt; oxidase en katalase in tabel 6.1

Experiment 9 ingezet en in de stoof (37 °C)

Werkplek gereinigd, afval in de afvalbak